Establishment of molecular methods for the detection and characterization of emerging bacterial pathogens in the State of Kuwait.

يعتبر تشخيص نوع الكائنات الدقيقة المجهرية هامة طبياً للمساعدة في عملية الوقاية والعلاج من الأمراض المعدية. وان استخدام طرق البيولوجيا الجزئية الحديثة لما لها من الدقة والحساسية الكبيرة في الكشف عن الميكروبات يعمل على المساعدة في التشخيص السريع للمرض والعمل على العلاج. في هذا المشروع لقد تم تأسيس ما يعرف بالبلمرة المتضاعفة Polymerase chain Reaction او ما يعرف ب PCR باستخدام طرق البيولوجيا الجزئية، وذلك لتشخيص المكيروبات المتعلقة والمسببة للالتهاب الرئوي الغير عادي "Atypical Pneumonia" مثل البكتيريا الشعاعية "Nocardia" وبكتيريا الفيلقية Legionella” " والبكتيريا المفطورية "Mycoplasma" والمتدثرات "Chlamydia". وهذه المكيروبات تعتبر صعبة العزل والتشخيص بالطرق الميكروبيولوجية الروتينية. وهذه الميكروبات تعتبر المسبب الأول لحالات عدوى الجهاز التنفسي السفلي وقد تكون مسؤولة لحوالي ثلث الحالات المعروفة بالالتهاب الرئوي الغير عادي. وقد تم فحص سبعين عينة طبية من مرضى مصابون بالتهاب الرئوي الغير عادي وتم الكشف عن 28.6% من العينات المصابة بالميكروبات الفيلقية "Logionella" وكانت نسبة الكشف والتشخيص أعلى بكثير من الطرق التقليدية والطرق المناعية التي استطاعت الكشف عن 15% فقط. وكذلك تم استخدام طريقة الكشف عن الميكروب لفحص عينات مياه من بعض مستشفيات الكويت وتم عزل الميكروبات الفيلقية من 70.6% في عينات المياه. ولقد تم عمل البصمة الوراثية باستخدام طريقة البلمرة العشوائية PAPD للدراسة الوبائية لهذا الميكروب في المياه. كما تم دراسة 40 عينة طبية من المستشفيات المختلفة وتم الكشف عن خمسة حالات إيجابية من الميكروبات الفطرية " Mycoplasma" بينما لم تكشف الطرق العادية كالمزارع البكتيرية عن أية حالة. ان التجارب التي تمت في المشروع استطاعت تحقيق وبنجاح طرق جزئية مبنية على استخدام تفاعلات البلمرة المتضاعفة PCR لتشخيص الميكروبات الشعاعية والفيلقية والمفطوريات والمتدثرات وهي الميكروبات الرئيسية المسببة للالتهاب الرئوي الغير عادي في معظم الأحيان. ان تقييم طريقة PCR أثبتت انها متفوقة وبكفاءة فيما يتعلق بدرجة حساسية هذه الطريقة خصوصيتها للكشف عن هذه الميكروبات دون غيرها واثبتت كفاءتها على الطرق المناعية والطرق البكتيرية الأخرى.

For the identification of Nocardia, a region of groEL gene that encodes hsp65 protein was targeted which gave a 422 bp DNA segment specific for Nocardia Spp, which was followed by a second amplification of 342 bp DNA (semi-nested PCR) by using a primer internal to the first amplicon. The semi-nested PCR developed in this study besides being more sensitive and rapid than culture, could also be used for detecting L-forms of Nocardia, which fail to grow on routine isolation media. We have established a genus-specific PCR for the detection of Legionella, and a species-specific PCR for the identification of Legionella pneumophila in clinical specimens. Seventy clinical specimens originating from patients with atypical pneumonia were tested for detection of Legionella. These results suggest that application of the PCR technique established in this study is more sensitive than the conventional tests in the specific diagnosis of human legionellosis. Although not included in the original plan, we have also done a pilot study to determine the occurrence of Legionella in water supply system in Kuwait. Of the 61 (23%) Legionella positive samples, 43 proved to be L. pneumophila. For the detection of Mycoplasma penumoniae, we tested three sets of primers. Sensitivity of PCR to detect M. pneumoniae DNA was found to be 1 pg which is equivalent to 100 genomes. In seeded clinical samples, 47 specimens were tested by PCR and culture. Five of them were found positive by PCR but none by culture. For detecting Chlamydia pneumoniae, a region of 16SrRNA gene which amplified 463 bp product was used. The limit of detection by PCR was found to be 12 pg of chlamydial DNA. Chlamydia pneumoniae DNA was successfully amplified from infected cell lines as well as BAL and lung homogenate specimens. The work accomplished in this project has successfully established PCR methods for the detection of Nocardia, Legionella, Mycoplasma and Chlamydia, the etiologic agents of atypical pneumonia. The evaluation PCR methods clearly indicated their superior efficacy in terms of sensitivity, specificity and rapidity over other methods (culture and/or serology).